在elisa實(shí)驗操作步驟中最易出現的十個(gè)問(wèn)題及處置解決方法

 

 

elisa實(shí)驗操作問(wèn)題一：無(wú)顏色

 

①實(shí)驗試劑孵育的時(shí)長(cháng)并沒(méi)有按產(chǎn)品說(shuō)明采用。

 

核對生物素化抗體，聯(lián)接的hrp實(shí)驗試劑或鏈霉親和素-hrp采用的時(shí)長(cháng)是不是合理。

 

②不同的試劑盒或不同的批號的實(shí)驗試劑混合使用。

 

從新查驗實(shí)驗試劑的標簽貼，保障全部組成部分都應屬正采用的試劑盒。不可以混合使用不同的試劑盒或不同的批號的實(shí)驗試劑。

 

③漏加酶

 

查驗操作步驟，特別注意不可以漏加。

 

④hrp酶影響了疊氮鈉

 

采用新制備的實(shí)驗試劑，禁含疊氮鈉

 

⑤標準品出現問(wèn)題（若在樣本孔中有數據信號）

 

按中海產(chǎn)品說(shuō)明查驗標準品的制備環(huán)節，采用一瓶新標準品

 

⑥某一器皿未清洗干凈,殘余滅活酶物質(zhì)

 

盡量避免用試劑盒器皿，另外找務(wù)必干凈整潔、安全可靠的容器。

 

⑦采用含血清的緩沖液制備/復溶抗體

 

從新核對所采用的實(shí)驗試劑

 

⑧漏加顯色劑a或b

 

加顯色劑后仔細觀(guān)察孔中液位相對高度

 

⑨實(shí)驗試劑制備/采用有誤

 

將試驗重新做，嚴格規范按產(chǎn)品說(shuō)明采用，每回制備和采用前看清楚標簽貼。

 

⑩緩沖液影響

 

制備新鮮的緩沖液

 

elisa實(shí)驗操作問(wèn)題二：顯色弱

 

①超出有效期限的企業(yè)產(chǎn)品或許會(huì )出現比較弱的數據信號。

 

查驗中海生物技術(shù)產(chǎn)品的有效期限

 

②添加實(shí)驗試劑的大小和時(shí)長(cháng)有誤

 

核對所采用的每一個(gè)實(shí)驗試劑的大小正確性和添加時(shí)間是合理。

 

③實(shí)驗試劑、試樣用前無(wú)法穩定平衡

 

用前實(shí)驗試劑、試樣置室內溫度穩定平衡十分鐘左右

 

④降低孵育時(shí)長(cháng)能使試驗的數據信號變弱。

 

查驗孵育的時(shí)長(cháng)。

 

⑤在溫度發(fā)生變化的區域環(huán)境內孵育酶標板。

 

核對孵育的溫度，應避免出現溫度的發(fā)生變化。

 

⑥采用了被影響的實(shí)驗試劑

 

查驗實(shí)驗試劑是不是被影響。

 

⑦標準品/樣本制備具體方法不標準規范

 

查驗標準品/樣本的制備，標準品應按產(chǎn)品說(shuō)明做好復溶和稀釋。低溫貯存的樣本避免出現反復凍融，禁止采用溶血樣本。試樣用nan3防腐,抑制了酶的反應。

 

⑧顯色底物制備不標準規范

 

查驗底物的制備，如大小是不是正確性，混合是不是適當充足。

 

⑨檢測時(shí)間不合理

 

是不是在規定標準的時(shí)長(cháng)內檢測。

 

⑩儀器設備設置有誤，濾色片不相匹配。

 

儀器設備是不是設置正確性，濾色片的選取是不是符合等。

 

elisa實(shí)驗操作問(wèn)題三：過(guò)多的數據信號，所有的板子變成規則的藍色。

 

①不充分的的洗滌/洗滌流程被疏忽-沒(méi)融合的過(guò)氧化物酶仍有殘余。

 

最好是采用洗板機充分的洗滌，檢測孔內是不是有殘余的洗劑或加樣量是不是準確。

 

②底物溶液混合過(guò)早并轉成藍色

 

應操縱底物混合的時(shí)間并馬上采用。

 

③過(guò)多的酶結合物

 

檢測稀釋度，有必要時(shí)開(kāi)展效價(jià)測定。

 

④封板膜或試劑器皿被多次重復使用，導致hrp殘余，使tmb底物出現非特異藍色。

 

采用新的封板膜，每一步采用不一樣的試劑器皿

 

⑤緩沖液中被污染金屬或hrp

 

制備最新緩沖液

 

elisa實(shí)驗操作問(wèn)題四：高cv值，花板

 

①操作步驟不規范或洗滌不充分的

 

按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)洗板/加樣/顯色，洗板極為重要。

 

②出現干板，并沒(méi)有采用封板膜、封板膜多次重復使用

 

確認每?jì)闪鞒涕g，酶標板應維持濕潤。采用封板膜封口，特別注意每一步采用新的封板膜。

 

③因為錯誤操作或板子品質(zhì)差、融合不勻稱(chēng)導致包板不勻稱(chēng)。

 

稀釋用的pbs中不必加其它蛋白，檢測包被和封閉液體積、時(shí)間和試劑添加的方法。檢測所采用的酶標板，采用elisa板，不必采用組織培養板。

 

④移液器不準確，吸頭多次重復使用。

 

檢測并校準移液器。每回取樣一定要換吸頭?？偨Y標本的添加流程，保障每回加樣的準確性，保證吸取的液體按所設定重量吸入和排出，持續加樣時(shí)特別注意檢測吸頭，保障所加液體的重量。

 

⑤樣品離心處置不全,反應孔內出現凝血或殘余細胞成份

 

標本充分在離心3000轉六分鐘以上，禁止采用凝血和溶血的標本

 

⑥緩沖液被污染

 

制備最新的緩沖液

 

elisa實(shí)驗操作問(wèn)題五：標準曲線(xiàn)可獲得，但低或平的曲線(xiàn)兩點(diǎn)之間差別很大。

 

①酶結合物不夠

 

檢測稀釋度，有必要時(shí)開(kāi)展效價(jià)測定。

 

②捕獲抗體并沒(méi)有很好融合到板上

 

檢測所采用的酶標板，采用elisa板，不必采用組織培養板，稀釋用的pbs中不必加其它蛋白。

 

③檢測抗體不夠

 

檢測稀釋度，有必要時(shí)開(kāi)展效價(jià)測定

 

④板子顯色不夠

 

延長(cháng)底物孵育實(shí)驗，采用中海生物品牌的底物溶液

 

⑤操作步驟不規范

 

總結elisa操作步驟，排除一切私自調整的程序流程。

 

⑥標準曲線(xiàn)稀釋度測算不正確

 

核查測算的具體情況，制備新的標準曲線(xiàn)

 

elisa實(shí)驗操作問(wèn)題六：標準曲線(xiàn)非常好，只是沒(méi)有任何期許的陽(yáng)性數據信號出現

 

①在樣本中無(wú)相對應的細胞因子

 

采用內參對照，反復實(shí)驗操作，慎重考慮實(shí)驗操作的相對應參數指標

 

②樣本基質(zhì)遮掩檢測

 

將樣本起碼做1∶2相對應的稀釋?zhuān)蜷_(kāi)展全系列稀釋觀(guān)測它的恢復性

 

elisa實(shí)驗操作問(wèn)題七：標準曲線(xiàn)非常好，只是樣本的判讀值很高。

 

①樣本中含的細胞因子水平超出檢測范疇

 

將樣本做稀釋并再度實(shí)驗操作

 

elisa實(shí)驗操作問(wèn)題八：當選用辣根過(guò)氧化物酶(HRP)結合物時(shí)，TMB底物加終止液后顯示為綠色。

 

①孔中的試劑顯色不全面

 

輕輕地振蕩板子

 

elisa實(shí)驗操作問(wèn)題九：邊緣效應

 

①工作中環(huán)境溫度不均衡化

 

防止將酶標板在變化溫度環(huán)境中孵育

 

elisa實(shí)驗操作問(wèn)題十：漂移

 

①實(shí)驗操作操作過(guò)程中出現間斷

 

整體實(shí)驗操作應持續操作使用：在實(shí)驗操作進(jìn)行前將全部標準品和樣本做合理的打算。

 

②試劑并沒(méi)有按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)穩定平衡至室內溫度

 

在全部試劑添加孔前，保障它們已穩定平衡至室內溫度，否則中海產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)中有除此之外的特殊要求。

 

其他問(wèn)題：

 

①是不是可更改檢測試劑盒所展示的實(shí)驗操作操作步驟？

 

通常情況下生產(chǎn)廠(chǎng)家為保障最大的靈敏度和特異性，對檢測試劑盒都開(kāi)展了優(yōu)化，為保障每個(gè)檢測試劑盒實(shí)驗操作的規范化應按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)操作使用。

 

②是不是可混用不一樣檢測試劑盒中的試劑？

 

不允許。其實(shí)是絕大部分試劑在每次檢測試劑盒中是特異性的，若有什么問(wèn)題可與生產(chǎn)廠(chǎng)家或總經(jīng)銷(xiāo)商溝通。

 

③是不是可增多或減少樣本的重量。

 

商品性的檢測試劑盒所需添加的樣本重量是優(yōu)化的，應按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)操作使用，不建議變更所加樣本的重量。

 

④是不是可重判定自身的標準曲線(xiàn)的點(diǎn)？

 

可以的。產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)上面有推薦的制備標準曲線(xiàn)時(shí)所需標準品的稀釋度，可更改稀釋倍數和增多曲線(xiàn)的點(diǎn)，只是務(wù)必在檢測范疇內，大于檢測試劑盒中最大標準品的點(diǎn)和小于靈敏度之下的點(diǎn)是不成功的。

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